Sexagem de embriões bovinos cultivados in vitro. Implementação de técnicas para aumentar a viabilidade após sexagem, congelação e descongelação.

Esta tese de Mestrado em Produção Animal de Isabel Alexandra Teixeira de Venido Carvalhais, orientada pelo Professor Doutor Moreira da Silva, do Departamento de Ciências Agrárias da Universidade dos Açores e pela Professora Doutora Rosa L. N. Pereira da Estação Zootécnica Nacional, teve como objectivo o desenvolvimento de métodos simples e precisos para a sexagem de embriões pré implantatórios e importante para a optimização do maneio reprodutivo bovino em programas de selecção e melhoramento. O objectivo da primeira experiência deste trabalho foi implementar um método de sexagem de embriões bovinos por reacção em cadeia da polimerase (PCR) e avaliar a distribuição de machos e fêmeas em função da qualidade e idade dos embriões produzidos. Os embriões bovinos produzidos in vitro (IVP) com meios suplementados com a soro caracterizaram-se por uma acumulação excessiva de lípidos no citoplasma aliada a uma grande susceptibilidade à congelação. Esta susceptibilidade é acrescida em embriões micromanipulados. A segunda experiência teve como objectivo melhorar a resistência dos embriões IVP a micromanipulação, congelação e descongelação, através da inclusão do isómero conjugado do acido linoléico — CLA (C18:2 trans-10, cis-12) no sistema de cultura tradicional com células da granulosa e soro. De igual modo, testou-se se a presença do CLA diminuía a deposição excessiva de lípidos característica dos embriões IVP e verificou-se se interferia no desenvolvimento embrionário.
Para a experiência 1 realizaram-se 17 sessões de produção de embriões. Oócitos bovinos aspirados de ovários recolhidos no matadouro foram maturados e fertilizados in vitro (FIV=D0). Ao 7º e 8° dia de cultura (TCM199 + 10% soro + células da granulosa), os embriões foram micromanipulados e recolhida uma biópsia para identificação do sexo. Na PCR, em Pit-stop foram utilizados dois pares de iniciadores: o primeiro par, adicionado apenas ao 7° ciclo, reconhece o DNA satélite bovino 1.715 (216 pb) e é amplificado nas fêmeas e nos machos. O 2° par amplifica um fragmento específico do cromossoma Y (174 pb) apenas presente nos machos. A eficiência da determinação do sexo foi inicialmente testada com DNA genómico de sangue de bovino com sexo conhecido e optimizadas as concentrações de DNA, dos iniciadores e de MgCl2 e as temperaturas de emparelhamento autilizar na reacção. A precisão do método foi avaliada por comparação do sexo diagnosticado em biópsias e respectivo embrião (n=14) e em duas biópsias (n=20) do mesmo embrião. Esta precisão foi de 100 e 100%, respectivamente. A eficiência do método para a sexagem dos embriões (n=47), avaliada pelo número de embriões com sexo identificado em relação ao número de embriões biopsiados, foi de 93,6%, podendo o sexo dos embriões ser determinado em 5 horas. A taxa de clivagem (embriões clivados! oócitos inseminados) foi de 73,8 ± 1,8 e de embriões D7-8 (embriões D7-8 embriões clivados) foi de 23,8±1,7%, não havendo diferenças significativas no sexo dos embriões (fêmeas:41% e machos:59%). A idade, a qualidade e o estádio de desenvolvimento não influenciou significativamente a distribuição do sexo dos embriões produzidos no sistema tradicional de cultura com células da granulosa e soro.
A experiência 2 foi realizada em 9 sessões. Oócitos maturados in vitro, 22 horas após a inseminação, foram divididos em dois grupos: TEST (n=822), cultivados com células da granulosa, TCM199, 10% soro e 100 µM GSH, e CLA (n925), cultivados com células da granulosa, TCM199, 10% soro, 100 µM GSH e 100 µM CLA. A co-cultura dos embriões prosseguiu até D7/D8. Embriões D7/D8 (TEST, n=l0, CLA, n=i 1) foram observados a fresco utilizando um microscópio com sistema Nomarski, procedendo-se a avaliação das gotículas lipídicas (GL) através da análise da área das GL e índice de gordura do embrião (IGE). De igual modo, embriões D7/D8 de ambos os grupos foram micromanipulados para diagnóstico do sexo e, posteriormente, congelados por vitrificação (TEST biopsiados n=20:CLA biopsiados, n=20). Também foram congelados embriões não rnicroimanipulados (TEST não biopsiados, n=35; CLA não biopsiados, n=37). Para avaliar a viabilidade destes embriões após congelação/descongelação, os embriões foram descongelados e colocados em cultura com monocamadas de células da granulosa (TCMI99, 10% soro e 100 µM (GSH). A suplementação do meio de cultura de embriões com CLA não influenciou as taxas declivagem e de embriões D7/D8, nem a qualidade ou distribuição do sexo dos embriões produzidos. No entanto, estes embriões têm GL de dimensões menores (TEST 10,33 ± 0,33 µm2vs CLA 7,1 ± 0,2 µm2 P=0,00001) e menores IGE (TEST 36,09 ± 2,33 % vs CLA 19,28 ± 2,87%, P=0,0003). Após a classificação dos embriões através das funções de classificação com base nas variáveis: IGE; área das GL <> 7 µm2 em gordos, médio e magros, verificou-se que os embriões cultivados sem CLA apresentam uma maior quantidade de gordura do que os embriões cultivados com CLA (P=0,008). No grupo TEST existem mais embriões gordos (P=0,004) do que no grupo CLA. Pelo contrário, neste último grupo foram identificados mais embriões médios (P=0,05) do que no grupo TEST. A cultura dos embriões em meios suplementados com CLA melhorou a resistência à congelação/descongelação dos embriões micromanipulados ou não micromanipulados. À descongelação, a taxa de integridade dos embriões do grupo CLA biopsiados foi maior (P=O,02) do que a dos embriões do grupo TEST biopsiados. Também a integridade dos embriões do grupo CLA não biopsiados foi maior (P = 0,02) do que a dos embriões do grupo TEST biopsiados. Após cultura dos embriões descongelados, a taxa de expansão às 24 horas dos embriões do grupo TEST biopsiados é significativamente inferior a todos os outros grupos (TEST, P= 0,03; CLA, P = 0,00008; CLA biopsiado, P= 0,003). Esta taxa é superior no grupo CLA em relação ao grupo TEST às 24 (P=0,06) e 48 (P=0,07) horas de cultura.Os resultados do presente trabalho mostram que o método implementado de recolha da biopsia embrionária por microssecção e PCR multiplex em Pit-stop é simples, preciso, rápido e economicamente comportável, podendo ser utilizado para a sexagem de embriões bovinos a transferir para vacas receptoras em fresco ou após congelação. A inclusão do CLA no sistema de cultura tradicional com células da granulosa e soro diminuiu a deposição de lípidos no citoplasma dos embriões, não interferindo nas taxas de produção ou qualidade dos embriões. A incorporação deste isómero do ácido linóleico no meio de cultura dos embriões permitiu melhorar a resistência dos ebriões IVP à micromanipulação, congelação e descongelação mesmo na presença de soro.